背景　

　紫外線がDNAに当たると、ピリミジン塩基（シトシンまたはチミン）が連続した箇所でピリミジン二量体という構造ができることがあります。なかでもシクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）は、ピリミジン塩基のC5およびC6炭素が、隣接するピリミジン塩基のC5'およびC6'炭素に共有結合しており、細胞内で紫外線によって発生する代表的な損傷DNAです。このような損傷が生じると、DNA複製や転写の妨げとなり、細胞死や突然変異、がん化など、細胞にさまざまな弊害をもたらします。
　DNA光回復酵素は、紫外線曝露により生じるCPDを修復する酵素です（図1）。この酵素は、反応に青色の光を必要とします。まず、酵素の反応中心にあるフラビン補酵素（FAD）がフォトン（光子）を捉えると、近傍のアミノ酸残基から電子を受け取って酸化型（FADox）から還元型（FADH–）に変化し、酵素によるDNA修復の準備が完了します。この反応は、光還元反応と呼ばれています。DNAはCPD部位で二重らせん構造が変形しており、DNA光回復酵素がそれを見つけてCPDを活性中心に収納します。この状態で酵素のFADH–が新たなフォトンを捉えて、電子をCPDに転移することでDNAが修復されます。このような反応経路は明らかになっていたものの、損傷DNAが修復される最中のDNAおよびタンパク質の立体構造は分かっていませんでした。この点を解明するために、反応中間体の原子レベル分解能での立体構造決定を試みました。

図1 光回復酵素による紫外線損傷DNAの修復
左）DNA光回復酵素の立体構造。DNA光回復酵素に青色光が当たると、反応中心のFAD（矢印）が酸化型（FADox）から還元型（FADH–）に変化する。NTD、CTDはそれぞれタンパク質のN端ドメイン、C端ドメインを示す。
右）シクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）の構造式（上）とDNA損傷のイメージ（下）。DNAの塩基配列の中にCPDができると、DNAの塩基対構造がゆがみ、複製や転写が妨げられる

 

　国際共同研究グループは、還元状態の古細菌のDNA光回復酵素のタンパク質を、CPDを持つDNAと暗所嫌気下で混ぜて結晶化し、反応直前の酵素―DNA複合体の結晶を準備しました。この結晶に反応のトリガーとなる青色光を当て、ピコ秒からサブミリ秒（1万分の1秒）の時間差でSACLAまたはSwissFELのビームラインからX線自由電子レーザーを照射し、回折光を検出しました。回折光から得られる数万のイメージデータから、タンパク質と修復DNAの立体構造を決定し、反応開始後の時間が異なるスナップショットを集めました。
　光回復酵素によるCPD修復は、青色光を照射して100ピコ秒後から始まっていました。FADH–からCPDへの電子移動により、酵素活性中心にあるアルギニン（R256）側鎖の立体位置が変わり、電子を受け取ったCPDを安定化させていました。その後、反応開始650ピコ秒後にCPDのC5-C5'結合が開裂し、反応開始1ナノ秒後にC6-C6'も同様に開裂することで、2塩基のピリミジンへと修復される様子を観察できました。反応に使用された電子は、フラビン補酵素に逆転移し、FADH–を再生することで次の修復反応に備えます。その後、酵素活性中心が反応前の状態へ戻ると、修復された二つのピリミジン塩基は、順番に回転して酵素活性中心から離れ、DNAの二重らせん構造が回復します。これには反応開始後200マイクロ秒と比較的長い時間を要し、連続した酵素反応の律速になっていることが見いだされました（図2）。このように、DNA光回復酵素が損傷DNAを修復する際の全ての原子メカニズムを、リアルタイムで解明しました。